Indhold
- etaper
- Metode 1 Identificer en bakterie efter Gram-farvning
- Metode 2 Udfør Ziehl-Neelsen farvningstest
- Metode 3 Undersøg bakteriers opførsel og udseende
- Metode 4 Fortolke alle resultaterne
Identificering af bakterier er en kompleks opgave. En af årsagerne er, at der ifølge estimater er mellem 10 000 og 1 milliard bakteriearter i verden! Korrekt identifikation af bakterier er meget vigtigt, især inden for det medicinske område, hvor korrekt behandling af en sygdom i vid udstrækning afhænger af den type mikrob, der forårsager problemet. I de fleste tilfælde foretages identifikation på grundlag af eliminering. For at identificere en bakterie skal du udføre farvningstest, analysere dens udseende og observere, hvordan den reagerer godt på forskellige forhold. Hvis du har brug for et hurtigt resultat, skal du tage en DNA-prøve for at sende til et laboratorium.
etaper
Metode 1 Identificer en bakterie efter Gram-farvning
- Bestem hvis bakterierne er Gram-positive eller negative. Gramfarvning er en metode til opdeling af bakterier mellem de to mest almindelige typer: Gram-positiv og Gram-negativ. Førstnævnte har en tyk cellevæg bestående af en polymer kaldet peptidoglycan, som har den bedste farvning som de tynde vægge af gramnegative bakterier.
- Nogle almindelige typer Gram-positive bakterier er streptokokker, stafylokokker, mikrokokker (eller mikrokokker) og listeria.
- Her er nogle almindelige eksempler på gramnegative bakterier: Neisseria, Acinetobacter, Moraxella, Enterobacteriaceae, Vibrio, Haemophilus, Fusobacterium og Campylobacter.
- Tag passende beskyttelsesforanstaltninger. De bakterier og kemiske elementer, du vil bruge under testen, udgør en risiko for dit helbred. Bær beskyttelsesbriller, engangs nitrilhandsker og en laboratoriecoat, når du udfører farvningstesten. Når du er færdig, skal du lægge handskerne og alle andre forurenede materialer i en speciel taske. Husk at følge procedurerne på dit laboratorium for at slippe af med posen til forurenede produkter.
- Sæt prøven, så den kan observeres på et glasglas. For at starte testen skal du placere en dråbe eller en bakterieprøve på et sterilt objektglas. Skub derefter klingen over en Bunsen-brænder, der er tændt tre gange for at fastgøre prøven og forhindre, at den kommer ud af pladen, når du skyller eller tilsætter reagenserne.
- Tilføj 5 dråber lilla krystal til klingen. Hæld fem dråber af en krystalviolet opløsning på prøven. Vent et øjeblik på prøven til at absorbere krystalviolet.
- Hold kniven på plads med tøjnåle, så du ikke pletter dine hænder.
- Vask kniven grundigt for at fjerne pletten. Brug et tryk eller en klemflaske, og lad vandet løbe meget langsomt i op til fem sekunder for at fjerne blækrester, der ikke har klæbet til prøven.
- Hæld fem dråber af en Gram Diode Stain på objektglasset. Det er en opløsning, der består af diode, natriumbicarbonat og kaliumdiodid, der får krystalviolet til at smelte med cellens vægge. Hæld fem dråber af opløsningen på prøven, og lad den stå i et minut.
- Vask prøven med alkohol eller mælkesyre. Alkohol og laceton er blegemidler og vil fjerne farvning af bakteriecellevægge, hvis de er Gram-negative. Hæld et par dråber blegemiddel på prøven, og lad den arbejde i højst tre sekunder. Prøv derefter at skylle forsigtigt med vand i fem sekunder for at fjerne disse blegemidler.
- Hvis du lader blegemidlet arbejde i lang tid, kan det resultere i, at Gram-positive bakterier farves, hvilket resulterer i en falsk negativ.
- Udfør en kontrasttest med safranin. Safranin er et rødt farvestof, der står i kontrast til krystalvioleten, hvorved bakterierne farves upåvirket af lilla farvning. Hæld cirka fem dråber safranin på prøven, og lad den stå i et minut. Prøv derefter at skylle forsigtigt med vand i fem sekunder.
- Visualiser din prøve ved forstørrelse på 1000 x. Bakterierne bliver lilla eller lilla, hvis det er Gram-positivt, eller lyserødt, hvis det er Gram-negativt på grund af safranin.
Metode 2 Udfør Ziehl-Neelsen farvningstest
- Brug denne teknik til at detektere syrehurtige bakterier. Disse arter indeholder en større mængde lipider, hvilket gør dem mere modstandsdygtige over for de farvestoffer, der anvendes i Gram-farvning. De syreresistente bakterier hører til slægten Mycobacterium, der inkluderer bakterien, der er ansvarlig for tuberkulose (M. tuberculosis). For at farve en syreresistent bakterie skal du bruge et rødt farvestof kaldet carbolic fuchsin, resistent mod skylning med sure eller svovlsyreopløsninger.
- Tag passende beskyttelsesforanstaltninger. Kemiske og biologiske materialer, der bruges under Ziehl-Neelsen-farvning, kan være farlige. Derudover skal du også bruge varmekilder, såsom en Bunsen-dyse, en elektrisk varmelegeme eller en alkohollampe. Følg instruktionerne herunder for at udføre testen.
- Sæt beskyttelsesbriller, nitrilhandsker og en lab frakke på.
- Pas på ikke at indånde dampe fra farvestoffer og blegemidler, og lad ikke dråber sprute øjne eller hud. Hold containere åbne under en hætte.
- Vær meget forsigtig, når du opvarmer klingen. De fleste af de anvendte kemikalier er brandfarlige. Der kan også være spor af brandfarlige stoffer på lysbillederne eller andet udstyr.
- Forbered klingen. Spred jævnt med en cirkulær bevægelse en lille mængde af bakterieprøven i midten af et sterilt objektglas. Din prøve skal besætte ca. 10 mm x 20 mm.
- Tør kniven. Placer klingen på tørringskonstruktionen med prøven opad. Lad det tørre naturligt i 30 sekunder. Forsøg ikke at tørre klingen med en klud.
- Fastgør prøven med varme. Skub klingen to eller tre gange med en prøve op over en tændt Bunsen-brænder. Du kan også placere klingen på en elektrisk varmeapparat ved at indstille temperaturen mellem 65 ° C og 75 ° C i mindst to timer. Pas på ikke at koge eller brænde prøven.
- Føj den karboliske fuchsin til klingen. Hæld flere dråber af denne opløsning på objektglaset. Hæld nok til at dække prøven helt.
- Opvarm klingen for at fastgøre farvestoffet. Varm objektglasset omhyggeligt over en Bunsen-brænder eller en alkohollampe, med prøven rettet opad, eller anbring den på en elektrisk varmelegeme. Opvarm klingen til 60 ° C, eller indtil det begynder at frigive damp. Lad farvestoffet virke i fem minutter.
- Hvis du bruger en elektrisk varmelegeme, skal du tænde den ved 60 ° C. Hvis du vælger alkohollampen eller Bunsen-brænderen, bør du forvente at se dampe.
- For at holde klingen på den ønskede temperatur i fem minutter skal du varme den op med mellemrum.
- Vær forsigtig med ikke at koge, brænde eller tørre prøven.
- Skyl bladet med koldt vand. Lad det afkøle i fem minutter, og skyl forsigtigt i nogle få sekunder med rent vand. Brug vand fra hanen eller en klemme til at fjerne farvestoffer, der ikke har klæbet til prøven.
- Hæld prøven sur alkohol eller svovlsyre. Brug et volumen på 3 volumenprocent (volumen / volumen) alkohol eller 20% svovlsyre for at dække prøven helt. Lad syren arbejde, indtil farven falmer og når en meget lyserød nuance. Processen tager normalt cirka ti minutter.
- Brug rent vand til at skylle klingen. Vask forsigtigt bladet under en kran eller ved hjælp af en flaske. Fjern alle syre- og farvestofrester godt.
- Tilføj kontrastmiddel. Når du har skyllet objektglasset, hæld farven på malachitgrøn eller methylenblå. Disse to opløsninger skaber en blålig eller grønlig baggrund, hvorpå det røde farvestof kommer frem, såvel som andre biologiske materialer, såsom humane celler og ikke-syrebestandige bakterier. Lad stofferne arbejde i et til to minutter.
- Skyl og tør kniven. Skyl grundigt med vand for at fjerne overskydende kontrast. Når du er færdig, skal du tørre bagsiden af klingen med en tør klud og lade det tørre naturligt på et stativ.
- Visualiser din prøve ved forstørrelse på 1000 x. De syrebestandige bakterier bliver røde eller mørkrosa. Andre bakterier, ikke-bakterielle celler og bunden af bladet bliver grøn eller blå.
Metode 3 Undersøg bakteriers opførsel og udseende
- Analyser formen på bakterierne. Efter at have udført farvningstesten for at bestemme, om bakterierne er Gram-positive, Gram-negative eller syre-resistente, er det på tide at identificere arten mere præcist. Først skal du analysere bakterienes form på objektglaset. De tre mest almindelige former er cocci (sfærisk), spiraler og baciller (stangform).
- Der er flere varianter af disse former. Rundformede bakterier (coccus) kan for eksempel forekomme i par (diplokokker), i kæder, i dynger eller i grupper på fire (tetrader).
- Find ud af, om bakterierne er aerobe eller anaerobe. Tag to prøver af bakterier og opret to separate kulturer. Månen skal være anaerob (dyrket uden ilt), mens den anden skal være aerob (dyrket med ilt). Opbevar den anaerobe kultur ved 35 ° C på et iltfrit sted i mindst 48 timer, før vækst observeres.
- Hvis bakterier vokser i et miljø uden ilt, men ikke når de udsættes for ilt, betyder det, at de er anaerobe.
- Selvom de udvikler sig i et oxygeneret miljø, men ikke i fravær af ilt, er de aerobe.
- Når de udvikler sig i begge miljøer, taler vi om fakultative anaerobe bakterier.
- Udfør en motilitetstest. En bakterie er mobil, hvis den kan bevæge sig alene med en eller flere flagella. Graden af bevægelighed er meget vigtig i identificeringen af visse bakteriearter. Der er flere typer af bevægelighed, men den sikreste og mest læselige måde er det halvfast medium.
- Opret en kultur til motilitetstesten. Forbered en kultur af bakterier i en kulturbuljong. Følg instruktionerne herunder for at forberede bouillon efter eget valg.
- Inokuler kulturen i en halvfast agar til motilitetstest. Overtræk en del af bouillonkulturen med en steril inokulationsnål. Plant nålen forsigtigt i det halvfaste dagrør, f.eks. TTC lagar, som du har forberedt til testen. Nålen skal trænge ind i 2/3 af agaren.
- Når du er færdig, skal du fjerne nålen forsigtigt og passe på ikke at overskride grænserne for inokulationszonen.
- Inkuber røret ved 30 ° C i 48 timer.
- Læs testresultatet. Agaren til motilitetstesten bliver rød ved kontakt med bakterier. Hvis de er mobile, spreder dette røde eller lyserøde farvning sig over hele stoffet. Ellers vil farvning være begrænset til injektionsstedet.
Metode 4 Fortolke alle resultaterne
- Saml dine kommentarer. For at kende den slags bakterier, skal du indsamle de oplysninger, der er opnået fra kulturerne, farvelægningstestene og observation af formerne. Hvis du undersøger en patients prøver, kan de symptomer, de præsenterer, også hjælpe med at bestemme den type bakterier, der er passende.
- Hvis testene for eksempel viser, at bakterierne er gramnegative, anaerobe, ikke-bevægelige, og du bemærker symptomer som mavesmerter, kvalme og opkast hos patienten, er det sandsynligt, at patienten lider af Bacteroides-infektion. fragilis.
- Se en database. Der er tusinder af bakterier i verden. Det er umuligt at vide alt udenom. Du bliver sandsynligvis nødt til at konsultere en klinisk mikrobiologibog eller online database for at sammenligne testresultater med information om bakteriearter.
- Der er fremragende online ressourcer til at identificere bakterier, men de fleste af disse databaser er tilgængelige på engelsk, herunder Patricbrc.org og GlobalRPh. Du kan dog stadig finde nyttige oplysninger på INRA International Microbial Resource Center websted.
- Foretag en genetisk test for at kende de nøjagtige arter af bakterierne. I nogle tilfælde skal du muligvis identificere bakteriens arter. Den hurtigste og nemmeste metode er at udføre en DNA-test. DNA-test er også nyttige til at identificere bakterier, der er resistente over for traditionelle former for farvning og kultur. I dag er DNA-test på mikroorganismer meget hurtige og kan være klar på mindre end to timer.
- Hvis du ikke har adgang til et laboratorium, der udfører genetisk sekventering af mikroorganismer, skal du sende en bakterieprøve til et specialiseret agentur.